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實時熒光定量PCR在檢測上主要應用這兩個方法
更新時間:2022-08-22   點擊次數(shù):582次
  實時熒光定量PCR在檢測上主要應用這兩個方法
  實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
  PCR是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系,所以成為定量的依據。
  所謂實實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
  檢測方法:
  1、SYBRGreenⅠ法:
  在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。
  SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
  PCR產物熔解曲線圖
  2、TaqMan探針法:
  探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物的形成*同步。
  技術原理:
  將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,完成高溫變性,低溫復性,適溫延伸的熱循環(huán),并遵守聚合酶鏈反應規(guī)律,與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷,熒光素游離于反應體系中,在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長,通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度,求得Ct值,同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照,即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。
 

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