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熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡
更新時(shí)間:2012-12-17   點(diǎn)擊次數(shù):1142次

一、儀器與試劑

1. TdT酶(25U/μl);

2. 生物素標(biāo)記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標(biāo)記的dUTP (Digoxingening-11-dUTP)1nmol/μl;

3. 反應(yīng)緩沖液;

4. 洗滌緩沖液;

5. 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素 (2.5μg/ml)或抗地高辛抗體(1:30);

6. PI染液(含PI 5μg/ml及0.1%無DNA酶活性的RNA酶);

7. PBS緩沖液;

8. 塑料蓋玻片;

9. 貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞;

10. 懸浮生長培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片;冰凍切片;常規(guī)石蠟切片。

二、操作步驟

1. 固定:培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后,用80%酒精再固定2h(-20℃冰箱);常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水合;

2. 洗滌:將玻片浸入PBS緩沖液,搖床上洗滌5min,三次;

3. 反應(yīng):洗滌后的玻片用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍水分,按50μl/cm2 滴加反應(yīng)液(每50μl反應(yīng)液含TdT酶0.5μl ,標(biāo)記的-dUTP 1μl),使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細(xì)胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h;

4. 終止反應(yīng):去掉塑料蓋玻片,將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi),洗滌2次,每次5min;

5. FITC標(biāo)記:洗滌后的玻片用吸水紙吸去細(xì)胞或組織周圍水分,按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液(含F(xiàn)ITC 2.5μg/ml),室溫下避光孵育10min;

6. 洗滌:將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi),洗2次,每次5min;

7. PI復(fù)染:將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi),室溫下避光染色30min

8. 封片:用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上,亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣,置暗盒中,盡早鏡檢觀察;

三、結(jié)果判斷

用熒光顯微鏡觀察,選用藍(lán)色激發(fā)光(波長488nm),所有的細(xì)胞核均被PI著色,顯示出紅色熒光,而凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上FITC,顯示出黃綠色熒光。

詳情請看:熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡

 

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