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利用流式細胞術分析細胞周期時相
更新時間:2013-01-11   點擊次數(shù):1230次

 詳情請看:利用流式細胞術分析細胞周期時相

一、實驗目的

掌握流式細胞儀的工作原理
掌握用流式細胞儀測量細胞群體DNA含量分布的方法
了解流式細胞術在細胞生物學研究中的應用

二、實驗原理

流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中,在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出,形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測,得到該細胞的光散射和熒光指標,分析出其體積、內(nèi)部結構、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學特征。

細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化,如G0/G1期的DNA含量為2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法,通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定,可分析細胞周期各時相的百分比。

三、儀器、材料與試劑

儀器:流式細胞儀,細胞培養(yǎng)設備,離心機,水浴,冰箱
材料:HeLa細胞,5ml注射器,離心管,封口膜,微量移液器,Tips
試劑:70%乙醇(保存于4℃),RNase-A (10mg/ml,-20℃保存)
PI (650µg/ml,避光保存于-20℃),PBS(pH 7.4,保存于4℃)

四、實驗步驟

1、取對數(shù)生長期細胞,倒去培養(yǎng)液,胰酶適度消化細胞,用培養(yǎng)液吹打,800rpm , 離心 15 min去上清。
2、PBS洗2次,加0.5mL PBS吹勻,務必吹散。
3、用5mL注射器將細胞吸起,用力打入5mL  70%(預冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定過夜(可長至2周)
4、800rpm 15min收集固定細胞,PBS洗2次
5、用0.4mL PBS重懸細胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打(防止細胞破碎)
6、加RNase-A約3µL至終濃度約為50µg/mL ,37℃水浴消化30 min;
7、加PI約50µL至終濃度約為65µg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。
8、用300目(孔徑40~50微米)尼龍網(wǎng)過濾,上機檢測。
9、樣品分析測定及打印。

 

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