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培養(yǎng)細(xì)胞染色體顯示法
更新時間:2016-04-15   點擊次數(shù):844次

 1.培養(yǎng)細(xì)胞:取處于指數(shù)生長期、用較大瓶皿培養(yǎng)的、80%~90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞。

 2.加秋水仙素:使用zui終濃度為0.02~0.8微克/毫升營養(yǎng)液,溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6~10小時;或用低溫封 閉法:把培養(yǎng)細(xì)胞置于4℃條件下6~12小時后,再于37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6~10小時處理(加秋水仙素)。

 3.采集分裂細(xì)胞:可利用分裂中期細(xì)胞體變圓與底物附著不牢特點,此時手持培養(yǎng)瓶,左右反復(fù)橫向 水平搖動,令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細(xì)胞表面反復(fù)沖刷。應(yīng)用此法可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落,注意勿用力過猛,以防多量非分裂細(xì)胞脫落影響觀察。

 4.離心:收集培養(yǎng)液,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5~10分鐘。

 5.低滲處理:吸除上清液、加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCl溶液,在溫箱中靜置20~30分鐘。

 6.預(yù)固定:向懸液中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打調(diào)勻,此措施能起到先使細(xì)胞表面輕微固定,可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。

 7.固定:離心,同4,吸除上清液,加新鮮固定劑5~10ml;加固定劑時要用一手微斜持離心管,另手用吸管吸取固定劑,把固定劑逐滴滴在離心管壁上,使之慢慢流入離心管中,然后輕輕吹打均勻,置15~20分鐘。

 8.重復(fù)7,末次離心后,小心吸除大部分上清,據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。

 9.制片:用滴片法制片,按如下步驟:*洗凈載物片,勿留任何油脂,置冰箱中儲備備用。滴片前現(xiàn)從冰箱中取出冷載物片1片,在載物片表面出現(xiàn)細(xì)微水氣時,立即向片的一側(cè)滴2~3滴細(xì)胞懸液,滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥,或用吹風(fēng)機熱風(fēng)吹干亦可。如此制備好的標(biāo)本可置盒中備用或立即進行染色觀察。

 10.染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合,染色10分鐘后,水洗、晾干、可直接觀察。如標(biāo)本需要保存或做長時間觀察,可過二甲苯兩次后,用中性樹膠封片后,再過二甲苯,然后封片亦可。

 

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